激光掃描體視顯微鏡采集的注意事項

激光掃描體視顯微鏡對于要觀察的區域，應先用明視場顯微鏡和普通熒光顯微鏡進行定位，當然也可使用共聚焦系統的體視顯微鏡進行定位。但對于大多數初學者或非專業研究人員來說，在只使用共聚焦模式的情況下，常很難找到合適的焦平面。所以應該學會使用共聚焦系統配備的顯微鏡，以常規模式預觀察樣品，因為要在一張含有數百個胚胎的標本中找出特定發育時期的某種基因的表達非常困難，如直接采用共聚焦模式掃描標本，常很費時。許多儀器具備快速掃描功能，可在一定程度上彌補這種缺陷，但在快掃模式下，其分辨率低。因此，當尋找少見的現象時，較容易的方法是使用普通模式觀察切片，一旦發現即刻切換到共聚焦模式進行圖像采集。

成功進行共聚焦圖像采集的關鍵是掌握透鏡NA，針孔大小和圖像亮度之間的互相配合，對于亮度，應以可獲得最佳圖像的最小激光強度為標準，即在保證成像的情況下，激光功率應盡可能小。可使用軟件的放大功能放大圖像，并將所得的圖像與高NA物鏡所得的圖像進行比較。在體視顯微鏡特定成像參數的設定操作時，應在標本要觀察的特定區域以外進行，防止有價值的區域發生光漂白。常包括設定PMT探測器的增益和背底水平，以及何時的針孔大小，保證在可接受的分辨率和足夠的反差之間獲得平衡，使用最低的激光功率以避免發生過多的光漂白。許多儀器具有顏色表，有助于設定圖像中的正確動態范圍。在8比特系統中，該表將最黑的像素設定為0.為偽彩綠色，而最亮的像素設定為255，為偽紅色。增益和背底水平以及針孔的調節，使其變化范圍在0-255之間，這種調節也可通過肉眼進行。但在進行實際圖像采集時，標本的熒光不均勻，可能超出范圍，因此，亮的區域可能遮蓋暗的區域。

采集的圖像常儲存在計算機的硬盤中，而后再進行拷貝。通常在圖像采集過程中，應采集盡可能多的圖像，如果需要刪除，可在隨后的圖像處理過程中刪除不滿意的圖像。有時開始看似不滿意的圖像，在日后的進一步復審中可能變得價值非凡，因此，在進行圖像刪除時，應慎之又慎！要與以前制備標本時各項條件保持一致，再復制制備標本非常苦難，有時是不可能的。